天美星空大象

鼠疫杆菌(驰笔-笔尝础/颁础/3础)荧光笔颁搁天美星空大象说明书

【产物名称】

通用名称：鼠疫杆菌(驰笔)核酸扩增天美星空大象(笔颁搁-叁色荧光探针法)

Name ：Diagnostic Kit for Yersinia Pestis DNA （PCR tripartite Fluorescence Probing）

【包装规格】48罢/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于检测全血等样本中的鼠疫杆菌，用于鼠疫杆菌感染的辅助诊断，其检测结果仅供参考。

【检验原理】

本试剂盒用一对 PLA 基因特异性引物，一对 3A 基因特异性引物，一对 伪CAFL 基因特异性引物，分别结合一条特异性荧光探针，用三色荧光 PCR 技术对鼠疫杆菌(YP)DNA 进行体外扩增，用于临床上对可疑感染者的病原学诊断。

【试剂组成】

名 称 规 格

核酸提取液 1.5ml×2 管

酶液 50μl×1 管

YP 反应液 1.0ml×1 管

YP 阳性质控品 50μl ×1 管

阴性质控品 250μl ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

【储存条件和有效期】

试剂盒保存于-20±5℃，有效期 12 个月；

避免反复冻融，冻融次数不超过 5 次；试剂开瓶后，在室温条件下放置时间不

应超过 8 小时；运输采用干冰（或者冰袋）保持低温，运输时间不应超过 4 天。试

剂盒生产日期见产物标签。

【适用仪器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ

Opticon2 等其他荧光定量 PCR 检测仪。

【标本要求】

标本采集：用注射器取血 5mL 至 EDTA-2Na 抗凝管

保存运输：上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过

6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。

【使用方法】

1. 样品处理（样本处理区）

1.1样本前处理

取抗凝血下层血细胞 50uL，加入 100uL 双蒸水吹匀

1.2DNA 提取

1) 对上述处理好的标本加入等体积核酸提取液（固体标本加入50uL核酸提取液），

100℃恒温处理 10 分钟，13,000 rpm 离心 5 分钟，取上清液转移至新的 1.5ml

EP 管，-20℃保存；

2) DNA 的提取也可以采用天美星空大象生产的 DNA 提取试剂

盒（离心柱提取法），请严格按照试剂盒说明书进行操作。

2. 试剂配制（试剂准备区）

根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性

对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：

试剂 YP 反应液 酶液

用量（样本数为 N） 20μl 1μl

3. 加样（样本处理区）

将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μl，分别加入相应的反

应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。

4. PCR 扩增（核酸扩增区）

4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；

4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25ul；

荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）

NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。

4.3 推荐循环参数设置：

步骤 循环数 温度 时间 收集荧光信号

1 1 cycle 95℃ 10min 否

2 40 cycle

94℃ 15sec 否

55℃ 30sec 是

5. 结果分析判定

5.1结果分析条件设定

设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出

现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围

内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上

下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。

5.2 结果判断

FAM通道为 PLA基因检测结果，CY5 通道为3A基因检测结果，VIC通道为 CAFL

基因检测结果。

1) 阳性：检测样本任意一个通道 Ct 值三个小于等于 35.0，且曲线有明显的指

数增长期；

2) 可疑：检测样本任意一个通道 Ct 值大于 35.0 且小于 40.0，重复一次实验，

如果 Ct 值仍小于 40.0，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；

3) 阴性：三个通道均检测不到样本 Ct 值。

6. 检测方法的局限性

Ø 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

Ø 样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

Ø 阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

Ø 病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

Ø 不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

Ø 试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或

定量检测不准确的结果；

Ø 本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。

7. 质控标准

阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；

阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32；

以上条件应同时满足，否则实验视为无效。

8. 产物性能指标

阴阳性参考品符合率：8 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合

率为 100％。

低检测限：2.0&迟颈尘别蝉;102肠辞辫颈别蝉/尘濒。

精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均≤3%。

【注意事项】

1.所有操作严格按照说明书进行；

2.试剂盒内各种组分使用前应自然融化，*混匀并短暂离心；

3.反应液应避光保存；

4.反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5.使用一次性吸头、一次性手套和各区工作服；

6.样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7.实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

8.试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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