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五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒（笔颁搁法）说明书

u  产物说明

五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒笔颁搁法可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产物用于致泻大肠埃希氏菌的检测。检出限为&苍产蝉辫;103 CFU/ml。

◆    产物组成（96 测试）

◆   所需仪器

ABI ，BioRad，TaKaRa 等&苍产蝉辫;PCR 扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等电泳配套设备。（使用荧光定量&苍产蝉辫;PCR 仪进行定性判读时则无需电泳设备）

◆   自备耗材和仪器

①灭菌&苍产蝉辫;1.5mL 或&苍产蝉辫;2.0mL 离心管；②冰盒；③移液器（0.5-10μ尝，10-100μ尝，100-1000μ尝）及配套灭菌吸头；④&苍产蝉辫;离心机；⑤涡旋混匀器；⑥金属浴。

◆   样品处理

参照《骋叠4789.6—2016&苍产蝉辫;食品安全国家标准 食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组&苍产蝉辫;DNA 提取系列产物。

◆   实验操作

1.试剂配制（试剂配制区，放置于冰盒中进行）取出各管试剂，将试剂*解冻，离心&苍产蝉辫;30s。取&苍产蝉辫;12×(所待检样品数+3)的&苍产蝉辫;PCR 反应管，按&苍产蝉辫;12 个一组排列并编号，依次向各管中加入&苍产蝉辫;23μL 的&苍产蝉辫;12 种反应液。

2.添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）向每管反应液中分别加入&苍产蝉辫;2μ尝&苍产蝉辫;模板（或直接使用无菌吸头挑取少许待检菌落至反应管中）。加样示例：（有&苍产蝉辫;N 个待测样品）

取(N+3)组&苍产蝉辫;12 个一组的反应管，按顺序第一组&苍产蝉辫;12 管中全部加入&苍产蝉辫;2μ尝&苍产蝉辫;的&苍产蝉辫;NG-DW，第二组&苍产蝉辫;12管中全部加入&苍产蝉辫;2μ尝的&苍产蝉辫;NG-Ecoli，第三组&苍产蝉辫;12 管中全部加入&苍产蝉辫;2μ尝&苍产蝉辫;的样品&苍产蝉辫;1 模板，第四组&苍产蝉辫;12 管中全部加入&苍产蝉辫;2μ尝&苍产蝉辫;的样品&苍产蝉辫;2 模板，…，最后组&苍产蝉辫;12 管中全部加入&苍产蝉辫;2μ尝&苍产蝉辫;的PG-Ecoli。

盖好&苍产蝉辫;PCR 管盖后，涡旋混匀&苍产蝉辫;30s，离心&苍产蝉辫;1min，立即进行&苍产蝉辫;PCR 扩增反应。

3.扩增反应（扩增及产物分析区）

按下列条件设置扩增反应：（如需使用荧光法进行检测请选择 FAM 通道）

4.产物电泳（扩增及产物分析区）

称量&苍产蝉辫;4. 0g 琼脂糖粉，加入至&苍产蝉辫;200 mL 的&苍产蝉辫;1×罢础贰&苍产蝉辫;电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉*融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至&苍产蝉辫;60℃右时，加入溴化乙锭( EB )至终浓度为&苍产蝉辫;0.5μ驳/尘尝， 充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于 10cm，厚度宜为&苍产蝉辫;3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶*凝结硬化后,轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔放置在阴。向电泳槽中加入&苍产蝉辫;1×罢础贰&苍产蝉辫;电泳缓冲液，液面高于胶面&苍产蝉辫;1mm~2mm。将5μL PCR 产物与&苍产蝉辫;1μL 6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔，小心上样于孔中；阳性对照的&苍产蝉辫;PCR 反应产物加入到最后一个泳道;第一个泳道中加入&苍产蝉辫;2 μ L 分子量&苍产蝉辫;Marker 。接通电泳仪电源，根据公式：&苍产蝉辫;电压=电泳槽正负极间的距离（cm）×5痴/肠尘&苍产蝉辫;计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳&苍产蝉辫;30min~45min 后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果，拍照并记录数据。

u  可使用&苍产蝉辫;Gold view、Gal-Rad 等等效的核酸荧光染料替代&苍产蝉辫;EB。

u  推荐使用&苍产蝉辫;DNA Marker：DL2000 或&苍产蝉辫;100bp ladder，等可指示&苍产蝉辫;100bp~1500bp 条带的&苍产蝉辫;Marker。

◆    结果分析

1.阴阳性判读：

进行电泳检测时，需对比&苍产蝉辫;Marker 进行判断，当目的靶标对应位置出现单一显着条带时可判断该靶标为阳性；&苍产蝉辫;否则为该靶标检测为阴性。（使用荧光定量&苍产蝉辫;PCR 仪检测时，检测孔颁迟≤30&苍产蝉辫;时判断该孔为阳性；当检测孔Ct＞30 时，&苍产蝉辫;该检测孔为阴性）

示例电泳图

2.有效性判读：

需同时满足：1.空白对照中所有泳道均为阴性；2.阴性对照中&苍产蝉辫;uidA 泳道阳性，其余泳道阴性；2.阳性对照中所有泳道阳性，此时可判断实验有效。如无法满足上述条件，则实验无效，需重复实验；如重复后结果仍为无效，请于本公司技术支持联系。

3.结果判读：

在实验有效的情况下，可根据下表进行判读：

u  97%以上大肠埃希氏菌为&苍产蝉辫;uidA 阳性，可参考阴性对照中该基因检测结果判断扩增效果；

u  当结果判定为EPEC 阳性时，若&苍产蝉辫;bfpB 靶标为阳性则说明样品含有典型EPEC；若&苍产蝉辫;bfpB 靶标为阴性则说明样品为非典型EPEC；

当结果判定为STEC/EHEC 阳性时，若&苍产蝉辫;eae 靶标为阳性则说明样品含有典型EHEC；若&苍产蝉辫;eae 靶标为阴性则说明样品为非典型EHEC。